上海交医院心内科
张学铭蔡宗烨李剑沈节艳
摘要肺动脉高压是一种可由多种病因引起的致死性疾病，表现为进行性肺血管阻力升高，右心负荷增加和功能衰竭，最终导致死亡。其病理变化主要为血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖增加、凋亡减少，肺血管结构重塑。microRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过与mRNA的3’端非翻译区域的结合来抑制相应基因的表达。多项研究发现，在肺动脉高压发生发展中，多种microRNA表达异常，并且部分microRNA表达量的变化与肺动脉高压的严重程度有关，使用某种microRNA抑制剂亦可以改善肺血管重塑，降低右心室负荷。这些研究表明，microRNA有望成为发现肺动脉高压及判断其预后的标志物，也可能成为改善肺动脉血管结构的治疗靶点。本文简要介绍microRNA在肺动脉高压中的作用。
关键字：肺动脉高压，microRNA，血管内皮细胞，平滑肌细胞，肺血管重塑
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肺动脉高压
1.1肺高血压的定义及分型
肺高血压（Pulmonaryhypertension，PH），是指肺内循环系统发生高血压，以肺血管阻力进行性增高为主要特征，其诊断标准为在海平面、静息状态下，心导管测定肺动脉平均压（meanPulmonaryArterialPressure，mPAP）＞25mmHg。在第五届世界PH会议上，根据引起PH的不同原因分为五类，分别为：肺动脉高压（PulmonaryArterialHypertensioPAH）、左心疾病相关性肺高血压、慢性肺部疾病和或缺氧相关的肺高血压、慢性血栓栓塞性肺高血压（Chronicthromboembolicpulmonaryhypertension，CTEPH）以及不明确的多因子机制引起的肺高血压[1]。
1.2肺动脉高压的病理变化
肺动脉高压是一种进展致死性疾病，异常的肺血管收缩和肺小动脉的内皮、平滑肌细胞增生、血栓形成等结构重塑导致肺血管不可逆的病理改变，表现为进行性肺血管阻力增加和心排量下降。目前PAH有三种主要类型：特发性PAH；家族性PAH；其他危险因素相关的PAH，例如HIV感染、先天性心脏病、胶原血管病等引起的PAH。与PAH相关的主要基因缺陷是编码骨形成蛋白受体2（BMPR2）的基因突变，但并不是所有携带该突变基因的患者都会发展为PAH，这些携带者的低外显率暗示了在PAH的发展过程中除了BMPR2的突变之外还有其他的因素在起着重要作用[2]。
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microRNA
2.1microRNA的定义及作用机制
microRNAs（miRNA,miR）是一种真核生物细胞内源性表达、长度约为22个核苷酸的非编码RNA。microRNA可以通过两种转录后机制来下调靶基因的表达：降解mRNA或是抑制基因翻译。成熟的miRNA选择性结合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）上，该miRNA的2-8个核苷酸可与靶mRNA的3’-UTR相结合。如果miRNA能与靶mRNA完全配对，靶mRNA即被裂解，若配对不完全，则会抑制该mRNA的翻译，导致基因沉默[3]。microRNA参与调控多种生命活动，包括造血、发育、器官发生、细胞增殖与凋亡，以及肿瘤的发生等。众多研究表明，在PAH的发生及进展过程中，多种microRNA的表达相应上调或下调，起到不同作用。
2.2microRNA在肺动脉高压形成过程中的作用
2.2.1miR-21
编码miR-21的基因位于17号染色体的编码跨膜蛋白49的基因中，通常表达于成纤维细胞、心肌细胞以及内皮细胞中[9]。在暴露于缺氧条件下的人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）、肺动脉内皮细胞（PAECs）及小鼠肺组织中均可发现miR-21的表达上调，PASMCs的增殖和迁移也会增加，同时对照组的PASMCs过表达miR-21后也会出现同样的结果，使用miR-21抑制剂处理后两组均出现表型的逆转[10]。这样的结果可能是由于miR-21的靶基因PDCD4、SPRY2和PPARα的表达下调引起[11]。而Caruso等人[4]在使用野百合碱（MCT）建立的PAH大鼠模型中观察到miR-21的表达下调，在使用TGF-β1和BMP4处理培养的PASMCs中也观察到了相同结果，但在慢性缺氧条件下诱导出的PAH大鼠身上没有看到同样的变化。目前miR-21的具体作用机制尚未完全清楚，仍需进一步探索研究。
2.2.2miR-
在PAH相关研究中，miR-被认为是一种抗细胞增殖、促进细胞分化的miRNA，缺氧条件下培养的PASMCs及血管纤维母细胞中或是PAH患者的纤维母细胞中miR-均出现表达下调。Kang[12]等人利用荧光素酶检测可以调节NFAT的miRNA,发现miR-可以通过多种靶基因强有力地抑制NFAT的活性及其脱磷酸和核转位，并抑制IL-2的NFAT依赖的转录过程。NFAT信号通路曾被发现与PASMC增殖及PAH有关，因此可以推测miR-可以通过NFAT通路来抑制PASMC的增殖。除了直接的抑制作用外，参与NFAT信号通路的NFATc1、CAMTA1和PTBP1也是miR-的靶基因，miR-亦可以通过对这些分子的调控来影响NFAT通路。
在PAH中，血管外膜的重塑与纤维母细胞的激活息息相关，包括其增殖、迁移和分泌炎性因子等变化。Wang[13]等人发现miR-除了可以影响PASMC的表型外，还可以促进纤维母细胞的增殖、迁移与炎症反应以及单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的表达。目前发现miR-对纤维母细胞的作用可以通过抑制其靶基因PTBP1来实现，体内实验和体外实验均发现在人肺动脉纤维母细胞中PTBP1表达上调，通过与PTBP1的3’端非编码区结合，miR-还可以调节其下游的Notch1/PTEN/FOXO3/p21Cip1和p27Kip1信号通路。
抗miR-药物会促进细胞增殖迁移以及MCP-1的表达，而过量的miR-可以抑制PASMC与纤维母细胞的增殖以及纤维母细胞的迁移。除此之外，miR-还可以被组蛋白脱乙酰酶抑制，因此如组蛋白脱乙酰酶抑制剂这类可以促进miR-表达的药物具有治疗PAH的潜力，需进一步开发研究。
2.2.3.miR-
miR-是发现的第一个与肺动脉重塑有关的miRNA,编码miR-的基因位于9号染色体、编码瞬时感受电位M3型（TRPM3）基因的内含子中。
在缺氧或者MCT诱导的PAH大鼠肺组织中miR-的表达下调，在PAH病人的肺组织标本中结果也是如此。目前认为，miR-通过Src-STAT3-NFAT/BMPR2信号通路发挥作用。在PAH发生初期，内皮素-1、PDGF等血管收缩因子在循环中的含量增加，激活STAT3，后者可直接结合于miR-,使其下调，而miR-的靶基因SHP2（一种酪氨酸磷酸激酶）表达增加，可激活Src并正反馈促进STAT3，这样的正反馈可能是导致肺动脉重塑进展迅速的原因之一。与此同时，STAT3可激活Pim1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)，后者再激活NFATc2。
Bonnet等人[14]发现NFATc2激活后可以抑制PASMC中电压门控钾离子通道（Kv1.5）的表达,进而影响细胞的去极化，使得电压门控钙离子通道打开，从而使得细胞内钾离子和钙离子的浓度上升，引起血管收缩和PASMC的增殖。不仅如此，NFATc2还可以促进Bcl-2(一种抗凋亡蛋白)的表达，导致细胞线粒体的超极化和细胞的凋亡抵抗[14]。除此之外，miR-还可以通过BMPR2信号途径发挥作用，在PAH病人中白介素-6（IL-6）的表达增加，IL-6可以激活STAT3,从而上调miR-17/92的表达，后者可以与BMPR的3’UTR相结合，抑制平滑肌细胞的增殖，miR-与miR-17/92通过同样的分子途径调节PAH的发生进展。
有研究报导，与对照组的PASMCs相比，IPAH病人PASMCs中miR-表达下调，肺动脉平滑肌细胞增殖增加，凋亡减少；使用人工合成的miR-类似物治疗MCT诱导的PAH大鼠则可以降低肺小动脉的压力及中膜厚度[15]。使用miRNA类似物治疗肺血管疾病也许是未来治疗策略的发展方向。此外，Wei等人[16]发现在人类血浆血沉棕黄层中miR-下降的水平可能与PAH的严重程度有关，miR-可能成为预测PH严重程度的循环标志物。
2.2.4.miR-/cluster
miR-与miR-的基因位于小鼠18号染色体上的一段保守区域，两者共用一个启动子和一条pri-miRNA[17]，同时也被认为在平滑肌细胞的表型转化中起着重要作用，可以促进平滑肌细胞从静止状态下的“收缩”表型转化为以细胞增殖和迁移为主的“合成”表型[18]。
miR-/的激活主要依赖于一种DNA元件，称为CArG盒。CArG盒包含于该pri-miRNA的启动子序列中，SRF、TGF-β、BMP4均可以通过该元件来促进miR-/的表达[19]。miR-与miR-有很多相同的下游靶基因，因此在调节mRNA翻译时可以共同发挥作用。miR-/的激活可以下调靶基因KLF4和KLF5的表达，继而可促进平滑肌特异基因的表达，如SMA、SM22-α和钙调理蛋白基因，这些基因表达的变化最终促进血管平滑肌细胞的分化并抑制其增殖。
研究表明，miR-/在PAH病人的肺动脉中，或者携带有BMPR2突变基因的病人的原代PASMCs培养中，及BMPR2缺失的小鼠肺组织中均表达上调[20]。在进一步实验中，与未处理的对照组相比，通过敲除小鼠miR-基因或者使用抗miR-药物处理小鼠均可以显著降低右心室压力以及重塑血管的数量。但是去除miR-并没有显示出与敲除miR-相同的保护作用[20]。因此随着对于miR-在影响肺部血管系统中信号通路的研究的发展，miR-很可能成为治疗肺部疾病的一个靶点。
2.2.5.miR-17/92cluster
编码miR-17/92簇的基因位于人类的第13号染色体上，miR-17/92是一个多顺反子RNA，可以生成六种成熟miRNA:miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-20a,miR-19b-1和miR-92-1，这六种miRNA来源于同一条pre-miRNA,每种miRNA均有自己的靶基因，因此miR-17/92的调节异常将影响大量基因的表达。MiR-17/92在细胞发生、增殖及凋亡的过程中起着重要作用，它是第一个确认参与肿瘤发生的miRNA，可以在各种肿瘤细胞中观察到其基因组扩增以及表达异常升高。
在PAH中，目前已知miR-17/92可以通过STAT3信号途径发挥作用。PAH患者体内IL-6含量升高以及过量IL-6可以诱导小鼠产生PAH均说明了IL-6参与了PAH的形成，在人肺动脉内皮细胞中发现IL-6可以激活STAT3[21]，在编码miR-17/92基因的启动子中有一段高度保守序列是STAT3的结合位点，通过此位点STAT3可以上调miR-17/92的表达，进而引起下游靶基因HIF1α的上调和BMPR2的表达下降[22]。
MiR-17/92还可以接受其他因子的调节。例如，Donnell等人发现转录因子c-Myc可以激活miR-17/92，继而抑制转录因子E2F1，后者可以反馈促进c-Myc和miR-17/92的表达，最终促进各种类型细胞的增殖并抑制其凋亡[23]。除此之外，p53可以抑制miR-17/92的表达。
有研究发现在缺氧诱导PAH的小鼠或者MCT处理的大鼠模型上使用抗miR-17和抗mi-92a药物可以抑制肺动脉的肌化，减轻肺血管的重塑，但只有抗miR-17药物可以降低右心室收缩压及右心功能不全的参数[24]。因此针对miR-17/92的治疗策略可能是未来治疗PAH的一个方向。目前关于miR-17/92的作用机制仍然不甚明了，为了解其在肺血管重塑过程中的具体作用以及调节方式仍需要进一步的研究。
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microRNA的临床应用前景
大量的研究证明miRNA在不同细胞、不同组织中的表达有其特异性，并且在相关疾病发生发展过程中可出现表达的异常改变，部分miRNA的表达的变化量可随疾病的严重程度变化而变化。Arroyo[25]发现循环中90%的miRNA可与Ago2形成蛋白复合体，可以防止被RNA酶水解，从而能在循环中稳定存在。基于miRNA的这些特点，部分miRNA有望成为早期诊断疾病或判断预后的标志物。但在分析循环中的miRNA时也存在一些困难，例如缺少标准的miRNA分子作为参考；暂时无法定量检测循环中的某种miRNA以及确定在疾病进展至何种程度时，相应miRNA会出现变化；缺乏纵向研究和大样本的研究等。
Brock[26]等人曾报导将抗miR-20a转染入人肺动脉平滑肌细胞可以激活BMPR2的下游信号，可以在缺氧诱导的肺高血压中防止血管重塑及平滑肌细胞增殖。
一些前临床试验也证明了miRNA在一些疾病中的地位，加之miRNA的小分子量、序列保守等优点，有望在未来使用miRNA类似物或者抗miRNA药物来治疗相应疾病。然而，由于单个miRNA常有多个靶基因,可能会带来很多其他的副作用，经过特定途径到达靶器官可以减小副作用，但目前仍面临着技术难关。
目前已有大量关于miRNA与PAH的研究成果，通过调节miRNA来抑制肺血管内皮细胞与平滑肌细胞的增殖、促进其凋亡具有很广阔的临床治疗肺动脉高压的前景，但仍有很多问题仍需要进一步的研究解答。
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专家简历
沈节艳，东方心脏病学会议肺循环论坛坛主，现任上海交通大医院心内科主任医师，医学博士，硕士生导师；上海医学会心血管病分会肺循环学组组长；中华医学会心血管病分会肺血管组委员;中国医师协会肺血管病专科医师培训专家顾问委员会委员;中国医师协会心脏重症专家委员会委员；上海女医师介入协会副会长；美国国际肺高压协会临床研究专员（PHA-PHCR）；亚太肺高压峰会专家委员；东方国际心血管病大会肺循环论坛坛主，历届长城国际心血管病大会、中国心脏大会、全国心血管年会等主席团成员。
沈节艳主任从医二十六年，擅长各型肺血管疾病的诊断与治疗，冠心病的介入诊断与治疗等。自90年代初即开始肺动脉高压的专项研究，先后发表有关肺动脉高压致病机理、超声早期诊断、心导管鉴别诊断和靶向治疗的SCI论著十余篇；参与编写大型学术专著5部。主持国家自然科学基金面上项目《肺动脉高压中miR-a-5p调控TGF-β1介导的肺血管重塑的机理研究》（）的课题研究，并参加国家十一.五攻关项目，十二.五攻关项目的研究；作为主要研究者（PI）参加国际多中心临床研究多项。并成功主持举办三届『浦江之声』上海地区肺血管病继续教育学习班。
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